Frodi alimentari: CE-TBP, un nuovo metodo per riconoscerle

La Dr.ssa Verdiana di Cesare ci introduce un problema che negli ultimi anni si è andato a rafforzare, quello delle frodi alimentari. La tracciabilità del prodotto è sempre più di pubblico interesse, e non è raro che i consumatori acquistino in base alle informazioni riportate sul packaging. Allo stesso tempo, sono aumentate le frodi, come nel caso della carne che è diversa da quanto viene dichiarato. Grazie alla metodologia CE-TBP il problema sembra essere sempre più vicino alla soluzione. Scopri come in questo nostro ultimo articolo.

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Cosa sono le frodi alimentari? E quali problematiche comportano?

Anche se la frode alimentare è un fenomeno ben radicato nel tempo, l’autenticità degli alimenti e la veridicità delle etichette alimentari sono problematiche attuali e sono oggetto di grande interesse per ricercatori, consumatori, legislatori e industria alimentare in tutti i vari livelli della filiera [1].

L’assunzione, da parte di alcuni consumatori, di alimenti a cui vengono aggiunti altri ingredienti non dichiarati (quali uova, alcuni vegetali, proteine del latte o altre specie di carne) può dare origine a reazioni allergiche o di intolleranza [2].

Un altro problema da prendere in considerazione è la violazione della libertà di scelta dei consumatori, in particolare quelli che scelgono di seguire rigorose diete per motivi religiosi (dal momento che il consumo di certe specie non è ammesso) [3] [4]. Numerosi metodi, basati su diversi principi, sono stati sviluppati per identificare più facilmente le frodi commerciali e, di conseguenza, contrastarle più efficacemente.

Le principali tecniche utilizzate per la tracciabilità molecolare degli alimenti sono quelle basate sull’uso di proteine, sulla misurazione dell’attività enzimatica e sull’analisi di acidi nucleici.

I metodi basati sull’analisi del DNA richiedono una conoscenza preliminare della sequenza bersaglio da ricercare. Tuttavia, tali metodi spesso necessitano di tempi lunghi e personale altamente specializzato o implicano una precedente raccolta di informazioni sull’ingrediente che si vuole identificare.

Tubulin-Based Polymorphism (TBP)

Il metodo TBP è stato sviluppato presso l’Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria del CNR di Milano ed è un metodo di riconoscimento di polimorfismi genetici basato sulla reazione di PCR, che amplifica il frammento di DNA corrispondente al primo e/o secondo introne della sequenza codificante del gene della β-tubulina presente in ogni specie vegetale. 

L’efficacia del sistema di individuazione di polimorfismi specie-specifici basato su TBP deriva dal fatto che ogni specie vegetale contiene un numero diverso di geni di β-tubulina, che può variare da 8 a 23, e ognuno di questi geni contiene introni di diversa lunghezza ma tutti collocati nelle medesime due posizioni interne alle sequenze codificanti (che, al contrario, sono molto simili nelle diverse specie). 

Bastano, quindi, due coppie di primer universali (diverse per i due introni) per innescare una reazione di EPIC-PCR (Exon-Primed Intron-Crossing-PCR) che conduce, in seguito a separazione elettroforetica, alla produzione di un bandeggio multiplo e alla definizione di un quadro di amplificazione genomica specie-specifico. 

In questo modo si genera un DNA barcode, che derivando dai polimorfismi di lunghezza presenti nei geni delle β-tubuline, viene denominato TBP (Tubulin Based Polymorphism) [5]. Successivamente questa tecnica è stata applicata anche sui vertebrati.

Dal TBP vegetale al TBP animale

Il TBP animale (a- TBP) è un metodo di riconoscimento di polimorfismi genetici basato sulla reazione di PCR, ma consiste nell’amplificazione di un frammento di DNA corrispondente al terzo introne della sequenza codificante del gene della β-tubulina presente in ogni specie animale.

Questo protocollo si basa sul principio per cui esiste un polimorfismo di lunghezza del terzo introne presente nel gene della famiglia delle β-tubuline: la posizione dell’introne viene conservata nelle diverse specie, ma varia la sua lunghezza. Utilizzando una sola coppia di primer, capaci di innescare l’amplificazione di tale introne nelle β-tubuline di tutti gli animali, si produce un profilo a più bande, caratteristico e specifico per ciascuna specie [7].

Il metodo TBP è stato successivamente abbinato alla tecnica dell’elettroforesi capillare CE-TBP, al fine di sviluppare un sistema automatico, riproducibile e con una sensibilità ed efficienza maggiori rispetto al sistema originale (in cui i frammenti intronici presenti nel prodotto di amplificazione TBP venivano separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide). 

Il CE-TBP, fondato anch'esso su una reazione di PCR, utilizza le stesse coppie di primer del metodo TBP classico, con la sola differenza che il primer viene marcato con un fluoroforo.

Durante l’elettroforesi capillare, l’aggiunta al campione di un marcatore costituito da frammenti di DNA a peso molecolare noto consente di determinare la dimensione dei prodotti di PCR visualizzati nell’elettroferogramma, dove ogni picco corrisponde a un certo introne della famiglia delle β- tubuline. 

I valori numerici registrati nell’analisi CE-TBP riportano le dimensioni degli introni, espresse in paia di basi con il relativo valore di fluorescenza (RFU: Relative Fluorescence Units) emessa dal prodotto amplificato e riconosciuta dal rivelatore [6] [7]. 

Rispetto all’elettroforesi tradizionale, questo metodo presenta una maggior capacità risolutiva, consentendo la risoluzione tra picchi che differiscono anche solo per una o due coppie di basi. L’elaborazione dei dati avviene tramite un software dedicato, che permette una semplice e riproducibile interpretazione dei dati e garantisce l’analisi di un elevato numero di campioni contemporaneamente (Figura 1).

I vantaggi del metodo TBP sono:

  • la capacità di discriminazione a livello di specie,
  • la non necessità di conoscere a priori le sequenze bersaglio,
  • l’identificazione di più componenti in una matrice alimentare,
  • l’identificazione di componenti inattese o sconosciute,
  • la semplicità, in quanto utilizza un’unica coppia di primer degenerati per una sola reazione di PCR e una sola corsa elettroforetica,
  • l’immediato riconoscimento di contaminazioni e dello stato di purezza delle materie prime,
  • la non necessità di ricorrere al sequenziamento,
  • l’utilizzo per la produzione di sonde molecolari specie-specifiche [7].
Fig. 1 - In figura vengono mostrati i principali risultati del metodo TBP. Le due versioni, applicabili rispettivamente agli organismi vegetali o animali sono mostrate con le loro fonti di polimorfismi di lunghezza degli introni. I frammenti amplificati ottenuti dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) possono essere analizzati con elettroforesi su gel (ottenendo delle bande) o con l’elettroforesi capillare (ottenendo dei picchi).

Possibili ambiti di applicazione

Negli organismi vegetali, il TBP è anche, talvolta, in grado di riconoscere le diverse varietà coltivate di una specie o sottospecie (per es. nel caso della vite) [8]. Questo lo rende più duttile e utile rispetto al sequenziamento dei tratti di DNA vegetale utilizzati per il DNA barcode basato su sequenziamento.

In tal senso, risultati significativi sono stati ottenuti sui mangimi utilizzati come integrazione nell’alimentazione dei bovini al pascolo, il cui latte viene destinato alla produzione di formaggi DOP [9] [10].

Il metodo si è rivelato utile anche nella ricerca di adulterazioni della farina di grano duro, utilizzata per la produzione di pasta, con farine ricavate da grano tenero [11].

Contrariamente a quanto riscontrato nelle piante, negli animali non si osservano generalmente polimorfismi intraspecifici dei frammenti amplificati con il metodo TBP (sono state analizzate differenti razze di bovini e ovini); tuttavia sono state rilevate alcune varianti alleliche nel pollo, con evidenti conseguenze sulla robustezza e l’integrità dell’analisi. 

Il TBP-animale è stato testato con successo su diversi tipi di DNA e miscele di carne, composte da quattro specie differenti e contenenti fino all’1% per ognuna di esse. Questa capacità diagnostica è stata confermata anche in miscele di carne cotta congelata/scongelata, che hanno mostrato una scarsa perdita di risoluzione, limitata alla scomparsa di frammenti più lunghi di 900 nucleotidi. 

Infine, il dosaggio TBP è stato applicato ad una vasta gamma di prodotti alimentari industriali trasformati disponibili sul mercato [7]. La Figura 2 mostra una di queste applicazioni, eseguita su un campione di tortellini il cui ripieno di carne è stato preparato con carne di maiale e manzo (Figura 2).

Fig. 2 - CE-TBP-animale applicato ai tortellini acquistati al supermercato e alle specie di riferimento (manzo e maiale). In ascissa sono riportati i pesi molecolari ed in ordinata le intensità di fluorescenza (RFU). I valori numerici si riferiscono alla lunghezza del frammento amplificato espressa in paia di basi.
Il CE-TBP rappresenta una valida alternativa alle tecniche molecolari attualmente utilizzate, in quanto consente l’identificazione delle diverse specie, la rilevazione di queste ultime anche all’interno di alimenti complessi e l’identificazione di ingredienti presenti solamente in tracce.
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1. Charlebois, S., Haratifar, S. (2015). The perceived value of dairy product traceability in
modern society: an exploratory study. Journal of Dairy Science, 98(5), 3514-3525.

2. Ballin, N.Z., Vogensen, F.K., Karlsson, A.H. (2009). Species determination - can we detect
and quantify meat adulteration? Meat Science, 83, 165-174

3. Rahman, M.M., Ali, M. E., Hamid, S.B.A., Mustafa, S., Hashim, U., Hanapi, U.K. (2014).
Polymerase chain reaction assay targeting cytochrome b gene for the detection of dog meat
adulteration in meatball formulation. Meat Science, 97, 404-409.

4. Nakyinsige, K., Man, Y. B. C., Sazili, A.Q. (2012). Halal authenticity issues in meat and meat
products. Meat Science, 91(3), 207–214.

5. Breviario, D. (2017). Is there any alternative to canonical DNA barcoding of multicellular
eukaryotic species? A case for the tubulin gene family. International Journal of Molecular
Sciences, 18 (4), 827-828

6. Gavazzi, F., Casazza, A. P., Depedro, C., Mastromauro, F., Breviario, D. (2012). Technical
improvement of the TBP (tubulin-based polymorphism) method for plant species detection,
based on capillary electrophoresis. Electrophoresis, 33 (18), 2840–2851.
Gavazzi et al. 2012)

7. Morello, L., Braglia, L., Gavazzi, F., Gianì, S., Breviario, D., (2019). Tubulin-Based DNA Barcode: Principle and Applications to Complex Food Matrices. Genes, 10(3). pii: E229. doi: 10.3390/genes10030229

8. Gavazzi, F., Braglia, L., Mastromauro, F., Gianì, S., Morello, L., Breviario, D. (2016). The
Tubulin-Based-Polymorphism method provides a simple and effective alternative to the
genomic profiling of grape. PloS One, 11(9), 330-335.

9. Casazza, A.P., Gavazzi, F., Mastromauro, F., Gianì, S., Breviario, D. (2010). Certifying the
feed to guarantee the quality of traditional food: an easy way to trace plant species in
complex mixtures. Food Chemistry, 124, 685-691.

10. Gianì, S., Casazza, A. P., Braglia, L., Gavazzi, F., Breviario, D. (2011). Feed To Milk: New
Tools For The Identification Of Plant Species. Animal Feed: Types, Nutrition And Safety.
Editor Borgearo S.R., Hauppauge, Nova Science Publisher, Inc., pp 219-238. (ISBN 978-1-
61209-346-8)

11. Casazza, A.P., Morcia, C., Ponzoni, E., Gavazzi, F., Benedettelli, S., Breviario, D. (2012). A
reliable assay for the detection of soft wheat adulteration in Italian pasta is based on the use
of new DNA molecular markers capable of discriminating between Triticum aestivum and
Triticum durum. Journal of Cereal Science, 56, 733–740

Verdiana Di Cesare

Verdiana Di Cesare

Dietista laureata in Alimentazione e Nutrizione umana, particolarmente interessata ai corretti stili di vita e alle politiche di riduzione dello spreco alimentare. Socia fondatrice dell'Associazione Recup contro lo spreco alimentare e l'esclusione sociale, in cui opera in qualità di consigliera e responsabile dei volontari.

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